در این روش معمولاً مخلوط که به صورت مایع یا گاز است از یک لوله یا شبکه گذرانده می‌شود؛ سرعت حرکت اجزای تشکیل دهنده مخلوط در لوله یا شبکه مختلف است (با توجه به عناصر دیواره داخلی لوله یا شبکه) در نتیجه مخلوط به اجزای تشکیل دهنده تجزیه شده و هر جز جداگانه خارج می‌شود. در کروماتوگرافی دو فاز وجود دارد فاز ثابت و فاز متحرک، فاز ثابت در واقع اجزای درون لوله یا شبکه جداسازی را تشکیل می‌دهند و فاز متحرک مربوط به ماده‌ای است که می‌خواهد مورد تجزیه و تخلیص قرار بگیرد. فاز ثابت می‌تواند مایع یا جامد باشد که بر اساس اینکه جامد یا مایع باشد به کروماتوگرافی جذب سطحی و کروماتوگرافی تقسیمی، تقسیم می‌شوند. اساس جداسازی در کروماتوگرافی متفاوت می‌باشد جداسازی براساس وزن مولکولی و جداسازی بر اساس میل اتصال به فاز ثابت از اهم این اصول می‌باشد. کروماتوگرافی یک اصطلاح کلی است که در آزمایشگاه‌ها برای جداسازی ترکیبات استفاده می‌شود. این ترکیب در مایعی به نام فاز متحرک حل شده‌است و توسط ساختار دیگری به نام فاز ثابت نگهداری می‌شود. اجزای مختلف این ترکیب با سرعت‌های مختلفی حرکت می‌کنند و همین امر باعث جداسازی این ذرات می‌شود. جداسازی بر اساس تفکیک دیفرانسیلی بین فاز متحرک و ثابت انجام می‌شود. تفاوت‌های نامحسوس در مقدار پارتیشن یک ترکیب در فاز ثابت باعث جدایی اجزا می‌شود. کروماتوگرافی می‌تواند مقدماتی یا تحلیلی (تجزیه‌ای) باشد. هدف از کروماتوگرافی مقدماتی جداسازی اجزا برای استفاده‌های پیشرفته می‌باشد. این در حالی است که کروماتوگرافی تحلیلی به صورت نرمال بر روی گروه کوچکی از مواد صورت می‌گیرد و برای اندازه‌گیری نسبت آنالیت‌ها در مخلوط می‌باشد. این دو با یکدیگر متناسب بوده و هیچ تضادی با یکدیگر ندارند.

انواع کروماتوگرافی

هر یک از چهار نوع اصلی کروماتوگرافی انواع مختلف دارد:

1-کروماتوگرافی مایع – جامد

• کروماتوگرافی جذب سطحی
• کروماتوگرافی لایه نازک(کروماتوگرافی تبادل یونی)
• کروماتوگرافی ژلی

2-کروماتوگرافی گاز – جامد

3-کروماتوگرافی مایع – مایع

• کروماتوگرافی تقسیمی
• کروماتوگرافی کاغذی

4-کروماتوگرافی گاز – مایع

1. کروماتوگرافی ستون مویین

 روش‌های کروماتوگرافی:

روش‌های کروماتوگرافی را می‌توان براساس معیارهای مختلف تقسیم‌بندی نمود، این معیارها شامل چگونگی تماس فازمتحرک و ساکن، حالت فیزیکی فاز متحرک و یا مکانیسم جداسازی می‌باشد.

 تقسیم‌بندی از نظر چگونگی تماس فاز متحرک و ساکن

روش‌های کروماتوگرافی بر اساس چگونگی تماس فاز متحرک و ساکن به دو دسته کلی کروماتوگرافی ستونی و مسطح تقسیم‌بندی می‌شوند. کروماتوگرافی مسطح نیز خود شامل کروماتوگرافی کاغذی و کروماتوگرافی لایه نازک است.

• کروماتوگرافی ستونی: در این روش فاز ساکن در درون لوله باریک به نام ستون تثبیت شده و سپس فاز متحرک از درون ستون به کمک نیروی گرانش یا یک نیروی خارجی حاصل از پمپ عبور می‌کند. 

• کروماتوگرافی مسطح: فاز ساکن روی یک سطح مسطح (می‌تواند کاغذ باشد "کروماتوگرافی کاغذی" و می‌تواند لایه‌ای از ذرات جامد باشد که روی یک تکیه‌گاه پخش می‌شوند"کروماتوگرافی لایه نازک") قرار گرفته است و فاز متحرک از طریق نیروی موئینگی یا یک نیروی خارجی از داخل فاز ساکن عبور می‌کند. ترکیبات مختلف موجود در مخلوط نمونه با توجه به شدت تعامل آن ها با فاز ساکن نسبت به فاز متحرک مسافت‌های مختلفی را طی می‌کنند. عامل خاص نگهداري (Rf) هر ماده شيميايي مي‌تواند براي شناسايي يك ماده ناشناخته مورد استفاده قرارگيرد. 

• کروماتوگرافی کاغذی: کروماتوگرافی کاغذی شامل قراردادن یک نقطه یا خط کوچک از محلول نمونه بر روی نوار کاغذ کروماتوگرافی است. کاغذ در یک ظرف با لایه کم عمق حلال قرارداده شده و مهروموم می‌شود. هر چه حلال از طریق کاغذ بالا می‌رود، به مخلوط نمونه رسیده و شروع به حرکت به سمت بالا می‌کند. این کاغذ از جنس سلولز، یک ماده قطبی ساخته شده و بنابراین اگر ترکیبات درون مخلوط قطبیت کمتری داشته باشند، مسافت بیشتری را روی کاغذ حرکت می‌کنند. مواد قطبی نیز با کاغذ سلولز سریع‌تر پیوند برقرار کرده و در کاغذ حرکتی نمی‌کنند.

• کروماتوگرافی لایه نازک: یک روش آزمایشگاهی است که به طور گسترده برای جدا کردن ترکیبات مختلف بر اساس جاذبه‌های نسبی آنها به فاز ساکن و متحرک، مورد استفاده قرار می‌گیرد. این روش شبیه به کروماتوگرافی کاغذی است. با این حال، به جای یک فاز ساکن کاغذ، از یک لایه نازک جاذب مانند سیلیکا ژل، آلومینا یا سلولز روی یک بستر مسطح و بی‌اثر استفاده می‌شود. مزیت این روش در مقایسه با کروماتوگرافی کاغذی؛ اجرای سریع‌تر، جداسازی بهتر، تجزیه و تحلیل کمی بهتر و انتخاب بین جاذب‌های مختلف که منجر به انتخاب‌پذیری بهتر نسبت به اجزاء مختلف مخلوط می‌شود؛ می‌باشد. در این روش نیز با داشتن میزان جابه‌جایی فاز متحرک (Xحلال) و جابه‌جایی استاندارد نمونه از یک سو به صورت مرجع و از سوی دیگر با تکرار آزمایش برای نمونه مجهول و میزان جابه جایی آن (X نمونه)؛ آنالیت مورد نظر را شناسایی کرد.

 تقسیم‌بندی بر اساس حالت فیزیکی فاز متحرک

روش‌های کروماتوگرافی براساس حالت فیزیکی فاز متحرک به دو دسته کروماتوگرافی گازی و مایع تقسیم می‌شوند، که در ادامه به معرفی این دو روش خواهیم پرداخت.

• کروماتوگرافی گازی: یک روش جداسازی است که درآن فاز متحرک یک گاز است. این روش مناسب گونه‌هایی است که نقطه جوش پایین داشته (کمتر از ۵۰۰ درجه سانتی‌گراد) و یا از نظرحرارتی پایدار هستند. جداسازی کروماتوگرافی گازی همیشه در یک ستون انجام می‌شود که به طور معمول "پرشده" و یا "موئینه" هستند. ستون‌های پرشده، ستون‌های معمول کروماتوگرافی گازی هستند که ارزان‌تر بوده و دارای کارکرد راحت‌تر هستند و اغلب عملکرد کافی را دارند. ستون‌های موئینه معمولاً وضوح به مراتب بالاتری دارند و گرچه گران‌تر هستند؛ به خصوص برای مخلوط‌های پیچیده، بسیار مورد استفاده قرار می‌گیرند. هر دو نوع ستون از مواد غیرجاذب و شیمیایی بی اثر ساخته شده است. کروماتوگرافی گازی مبتنی بر ضریب تقسیم آنالیت بین فاز ساکن جامد یا مایع ویسکوز (اغلب یک ماده سیلیکونی مایع) و یک گاز متحرک (اغلب هلیوم) است. این روش به طور گسترده در شیمی تحلیلی مورد استفاده قرار می‌گیرد. گرچه درجه حرارت بالا مورد استفاده در GC، آن را برای بیوپلیمرهای با وزن مولکولی بالا یا پروتئین‌ها مناسب نمی‌کند (گرما آنها را تخریب می‌کند)، اما برای استفاده در پتروشیمی، نظارت بر محیط زیست و زمینه‌های شیمیایی صنعتی مناسب است. همچنین در تحقیقات شیمی بسیار مورد استفاده قرار می‌گیرد.

کروماتوگرافی مایع: یک روش جداسازی است که در آن فاز متحرک یک مایع است که می‌تواند آنالیت را در ستون یا سطح حمل کند. کروماتوگرافی مایع امروزی که در آن از ذرات پرکننده بسیار ریز و از فشار نسبتاً بالایی استفاده می‌شود، به عنوان کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) یاد می‌شود. در HPLC نمونه توسط مایع در فشار زیاد (فاز متحرک) از طریق ستونی با یک فاز ساکن متشکل از ذرات به شکل نامنظم یا کروی در یک لایه یکپارچه متخلخل؛ حمل می‌شود. HPLC از نظر تاریخی بر اساس قطبیت فاز ساکن و متحرک به دو گروه تقسیم‌بندی می‌شود:

1. کروماتوگرافی مایع با فاز عادی: که در آن فاز ساکن قطبی‌تر از فاز متحرک باشد (به عنوان مثال، تولوئن به عنوان فاز متحرک، سیلیس به عنوان فاز ساکن)
2. کروماتوگرافی مایع با فاز معکوس: که در آن فاز متحرک قطبی‌تر از فاز ساکن باشد (به عنوان مثال، مخلوط آب و متانول به عنوان فاز متحرک، C18 (اکتادسیلسیلین) به عنوان فاز ساکن)

 تقسیم‌بندی بر اساس مکانسیم جداسازی

روش‌های کروماتوگرافی را می‌توان براساس مکانیسم جداسازی نیز تقسیم‌بندی نمود که از بین آنها به سه دسته کروماتوگرافی جذب سطحی، تعویض یونی و غربالی می توان اشاره کرد.

• کروماتوگرافی جذب سطحی: نمونه‌ای از کروماتوگرافی جامد – مایع است که درآن جداسازی مواد به علت متفاوت بودن جذب سطحی اجزاء مختلف مخلوط و فاز ساکن انجام می‌گیرد. سرعت حرکت هر جزء‏، به میزان جذب سطحی آن بر روی ماده داخل ستون بستگی دارد. به این ترتیب، ماده‌ای که کم جذب شده است، سریع‌تر از ماده‌ای که زیاد جذب شده است، حرکت می‌کند. واضح است که اگر اختلاف بین جذب‌های سطحی به حد کافی زیاد باشد، جداسازی مواد بصورت کامل انجام خواهد گرفت. اجزایی که قابلیت جذب بالاتری دارند، در قسمت بالای ستون و اجسامی که کمتر جذب می‌شوند در قسمت‌های پایین ستون، جذب خواهند شد.

• کروماتوگرافی تعویض یونی: فاز متحرک مایع و فاز ساکن معمولا یک رزین است که خاصیت تبادل یون دارد. نوع تعادل، تعویض یون‌های آنالیت با یون‌های رزین است. بنابراین، این روش برای جداسازی اجزاء یونی یا گونه‌هایی که بتوان به نحوی آنها را به یون تبدیل کرد، مناسب است. همانطور که در شکل(۸) مشاهده می‌کنید استفاده از رزین با بار مثبت توانایی جذب پروتئین باردار شده منفی را داشته و می‌تواند آن را جداسازی کند.

رزین‌ها (جاذب‌های مصنوعی) از ذرات پلیمری متقاطع کروی ساخته شده‌اند، که دارای ساختار متخلخل(پر حفره) هستند. جذب ترکیبات به جاذب‌های مصنوعی بیشتر ناشی از برهمکنش آب‌گریزی بین ترکیبات و جاذب‌ها می‌باشد. رزین‌های تعویض یون دارای انواع کاتیونی (اسیدی) مثل گروه (R-COOH و R-SO3H) برای جداسازی کاتیون‌ها و آنیونی (بازی) مثل گروه (+R-NH3-Cl) برای جداسازی آنیون‌ها هستند. به طور مثال در جاذب‌های اسیدی گروه COOH به بستر Rمتصل هستند که به -COO تبدیل می‌شوند. حال این جاذب توانایی جذب یک کاتیون به طور مثال نقره +Agرا دارد و جداسازی صورت می‌گیرد.

کروماتوگرافی طرداندازه (غربالی): در این روش فاز ساکن، مایعی است که در میان حفرات یک بستر پلیمری محبوس شده است. نوع تعادل بر اساس غربال اندازه است به گونه‌ای که بستر پلیمری دارای حفرات با اندازه مشخص بوده که به مولکول‌ها با اندازه معین اجازه می‌دهد به این حفرات راه پیدا کنند و پس از ورود به این حفرات مابین فاز ساکن توزیع شوند. پس در این روش ابتدا مولکول‌های درشت‌تر از ستون خارج شده و سپس مولکول‌های ریزتر. این روش برای مولکول‌های با جرم مولکولی بالا مثل پلیمرها استفاده می‌شود.

کروماتوگرافی یکی از متداول‌ترین روش‌های جداسازی و شناسایی مواد است. امروزه کروماتوگرافی کاربرد وسیعی در بسیاری زمینه‌ها شامل شیمی، داروسازی، پتروشیمی، مواد غذایی و ... پیدا کرده است. روش‌های کروماتوگرافی در جداسازی مخلوط ترکیبات، شناسایی ترکیبات ناشناخته، تخمین خلوص و غلظت مواد، نظارت در تولید دارو در صنایع داروسازی و ... کاربرد بسیاری دارند. در کروماتوگرافی، جداسازی بر اساس تمایل اجزا یک نمونه بین دو فاز و اختلاف در سرعت مهاجرت گونه‌ها است، به صورتی که اختلاف کمی در ضریب تقسیم آنها بین فاز ساکن و متحرک منجر به تفاوت در زمان بازداری در فاز ساکن شده و باعث تاثیر در جداسازی می‌شود. در این مقاله توضیح کلی درباره مبانی اولیه کروماتوگرافی و انواع آن داده شد.